Le but de ce document est d'exposer une démarche d'investigation qui peut être utilisée pour évaluer et comprendre l'état et l'évolution de l'écosystème microbien dans les tours aéroréfrigérantes (TAR), grâce l'utilisation d'outils modernes et innovants. La méthode de détection des légionelles par PCR en temps réel est utilisée comme un outil de diagnostic, de management des risques et de mesure d'efficacité des différents traitements. Il est nécessaire d'étudier le plan d'installation de la TAR, afin d'y effectuer des séries de prélèvement, à des points différents choisis avec l'appui de l'analyse des risques et pour vérifier les objectifs poursuivis par le traitement de l'eau. L?évaluation de l'écosystème microbien et des populations de légionelles nous permettent de conduire et d'optimiser les actions préventives ou correctives nécessaires.
Il est nécessaire d’étudier le plan d’installation de la TAR, afin d’y effectuer des séries de prélèvements, à des points différents choisis avec l’appui de l’analyse des risques et pour vérifier les objectifs poursuivis par le traitement de l'eau.
L’évaluation de l’écosystème microbien et des populations de légionelles nous permettent de conduire et d’optimiser les actions préventives ou correctives nécessaires.
Les connaissances acquises sur les légionelles grâce à une étude bibliographique nous permettent de synthétiser les éléments sur leur mode de vie, les conditions de prolifération et sur l’évaluation de l’efficacité d’un traitement.
Connaissances bibliographiques relatives à Legionella
Legionella, bactérie ubiquitaire autochtone des milieux hydriques continentaux, colonise facilement les circuits industriels notamment par les TAR (14 000 TAR concernées par la réglementation applicable : Rubrique 2921 et arrêtés ministériels), représente un risque en Santé Publique, objet de mesures de prévention dans le cadre du plan d'action gouvernemental contre la légionellose.
Le genre Legionella est composé de 48 espèces. Parmi celles-ci, c'est à Legionella pneumophila que l'on attribue 95 % des cas.
Type de tours aéroréfrigérantes concernées
- TAR soumises à autorisation ou déclaration, à fonctionnement saisonnier ou permanent (avec ou sans possibilité d'arrêt)
- TAR ouverte
- TAR hybride ouverte
- TAR ouverte + échangeur
Tableau diagnostic d’évaluation
Points de prélèvement
- Eau d’appoint
- Points du circuit TAR
- Biofilms
- Aérosol
Phénomènes biologiques observés
- Cultivabilité des légionelles
- Présence de biofilms
- Présence d’amibes
- Comportement de l’installation vis-à-vis de l’augmentation des populations de la flore totale et des légionelles
- Présence de légionelles dans les aérosols
Objectifs visés
- Efficacité de surveillance
- Établissement des niveaux limites d’alerte
- Niveau d’action
- Compréhension du réacteur biologique
- Maîtrise des points de contamination
Le diagnostic évaluation a pour objectif d’estimer le risque réel de développement des Legionella en tenant compte de l’écologie de Legionella (différents compartiments tels que : eaux, biofilms et air).
De légionellose même si 18 espèces ont déjà été identifiées comme « pathogènes ». Les légionelles ont un développement endosymbiotique dans les amibes et ne semblent se diviser qu’en leur présence. Le transport des légionelles via les aérosols serait possible sur de longues distances grâce à un empaquetage dans une vésicule issue de Ciliés. Les données actuelles sur l’écologie des légionelles la présentent comme une bactérie naturellement présente dans les eaux froides souterraines ou superficielles. Ce sont les sources de contamination des installations à partir desquelles les eaux sont prélevées pour le fonctionnement des TAR.
Les légionelles majoritairement dans les biofilms peuvent survivre dans l’environnement plusieurs mois par « starvation » grâce à des réserves d’énergies accumulées sous forme de polymères osidiques.
Dans l’environnement, Legionella pneumophila est très largement minoritaire si l’on se base sur des analyses de biologie moléculaire. Par la méthode de référence NF T90-431, l’espèce L. pneumophila représente la majorité des échantillons positifs. En effet, cette méthode est beaucoup plus efficace pour cultiver Legionella pneumophila que pour révéler la présence de Legionella spp. non pneumophila. De fait, cette méthode a été optimisée (température d’incubation et composition des milieux gélosés) pour la première espèce pathogène isolée et identifiée aux États-Unis, à la fin des années 1970.
Du point de vue des réglementations, les TAR sont concernées par une limitation de la concentration en Legionella spp, toutes espèces confondues, alors que la réglementation ECS concerne uniquement L. pneumophila.
Dans tous les cas, les réglementations sont relatives à la méthode de référence qui dénombre les bactéries cultivables (Unité Formant Colonies) à 36 ± 2 °C sur les milieux spécifiés de la norme après un délai d’incubation de 8 à 10 jours. De ce fait, 95 % des échantillons positifs sont positifs à L. pneumophila.
Les légionelles viables (ayant un potentiel de culture dans l’environnement en présence d’amibes ou dans un biofilm) sont présentes dans une installation sous deux formes : viable cultivable (VC) et viable non cultivable (VBNC). Les techniques de mesures ayant recours à la PCR s’adressent à la somme des deux (VC + VBNC exprimés en Unité génome/l). La réglementation en matière de TAR est basée uniquement sur la fraction cultivable (VC exprimé en Unité Formant Colonie/l).
Une centrale thermo-réfrigérante est un réacteur biologique complexe, non uniformément mélangé, dans lequel le ratio VC/(VC + VBNC) peut varier de 0 à 100 %. Il est donc rigoureusement impossible de prédire un résultat en Unité Formant Colonie à partir d’un résultat PCR exprimé en Unité Génome.
Seul un résultat négatif en PCR est prédictif d’un résultat négatif en culture (si VC + VBNC = 0, alors VC = 0). Un très large consensus existe dans la communauté scientifique sur ce point. L’ensemble des études scientifiques publiées à ce jour montre une absence de corrélation stricte entre les deux méthodes.
6 indicateurs
- UFC
- BIOFILM
- AMIBES
- PCR EAU
- Data ATP
- Data PCR
Méthodes
- AFNOR T90-431 (ISO 11731)
- PCR Legionella spp en log (UG/25 cm³)
- Dénombrement sur boîte NPP
- PCR Legionella spp XP T 90-474 en log (UG/l)
- Point – Appoint en log (RLU)
- Point – Appoint en log (UG/l)
Fiche de synthèse “Outils de mesure” adaptés à la surveillance du risque Legionella sur tour aéroréfrigérante
| Technique analytique | Unité de mesure | Interprétation | Description et commentaire de l’analyse | Outil/offre technique BIO-RAD |
|---|---|---|---|---|
| Dénombrement des Legionella spp et pneumophila dans l’eau par méthode PCR | Unité Génome par litre (UG/l) | Dénombrement des Legionella totales quel que soit leur état physiologique, y compris celles hébergées par les protozoaires | Cette technique permet de quantifier avec précision la concentration des bactéries : filtration de l’échantillon d’eau sur membrane polycarbonate de porosité 0,45 μm, extraction et purification de l’ADN, amplification par PCR et détection par sonde fluorescente spécifique. | Aquadien™ Kit + IQ-Check™ Quant Legionella spp et Legionella pneumophila |
| Dénombrement des Legionella spp dans le biofilm par méthode PCR (Tech. Note BIO-RAD 16995) | Unité Génome par 25 cm² (UG/25 cm²) | Dénombrement des Legionella totales hébergées par le biofilm | Prélèvement de biofilm par écouvillonnage d’une surface de 25 cm², suivi d’extraction, purification et amplification identiques à celles de l’eau. | Aquadien™ Kit + IQ-Check™ Quant Legionella spp et Legionella pneumophila |
| Dénombrement des Legionella spp présentes dans des protozoaires et les matières en suspension (biofilm détaché…) | Unité Génome par litre (UG/l) | Dénombrement des Legionella présentes dans des protozoaires et débris en suspension | Filtration sur membrane de porosité > 0,45 μm : les Legionella libres passent, les morceaux de biofilm et les amibes sont retenus, puis protocole PCR classique. | Aquadien™ Kit + IQ-Check™ Quant Legionella spp et Legionella pneumophila |
| Dénombrement des amibes dans l’eau (Tech. Note BIO-RAD en cours de rédaction) | Nombre d’amibes par litre (l) | Recherche et dénombrement des amibes libres dans un échantillon d’eau | Filtration d’un litre d’échantillon sur membrane 0,45 μm, ensemencement par dilution NPP sur boîte nappée d’Escherichia coli puis incubation à 37 °C. | – |
| Mesure de l’ATP (Adénosine Triphosphate) dans l’eau | Unité de Lumière Relative (Log RLU) | Évaluation de la charge microbiologique de l’eau analysée | L’ATP, coenzyme énergétique intracellulaire, est un marqueur spécifique des milieux vivants ; toute trace d’ATP révèle la présence ou le passage de cellules vivantes. | – |
| Dénombrement des Legionella spp et pneumophila dans l’air (Tech. Note BIO-RAD 16186) | Unité Génome par m³ (UG/m³) | Prélèvement des Legionella totales, quel que soit leur état physiologique, dans l’air | Le CIP10-M Biocollecteur prélève l’air et piège les aérobio-contaminants sur un liquide ensuite analysé par PCR. | CIP10-M Biocollecteur + Aquadien™ Kit + IQ-Check™ Quant Legionella spp et Legionella pneumophila |
Entre UFC et Unité génome. Un étalonnage “installation TAR dépendant” n’a pas de sens car le ratio VC/VC+VBNC varie dans le temps.
Méthode de surveillance optimisée en matière de gestion du risque Legionella sur tour aéroréfrigérante
Cette méthodologie a été mise au point, testée et validée sur des installations de refroidissement dans le cadre d’une action collective rassemblant des professionnels de l’agro-alimentaire, des laboratoires de recherche publique, des équipementiers et des traiteurs d’eau, soutenue par la DRIRE LR et la région Languedoc-Roussillon.
Elle comprend le contrôle réglementaire (arrêté décembre 2004 rubrique 2921), un diagnostic d’évaluation et un Plan de surveillance détaillé, avec des outils de mesure microbiologiques adaptés. Les informations recueillies sont corrélées à l’hydraulicité de l’installation, à la qualité de l’eau du circuit et aux caractéristiques du traitement appliqué (biocide, biodispersant, traitement physique…).
Type de tours aéro-réfrigérantes concernées
- – TAR ouvertes
- – TAR fermées
- – TAR soumises à autorisation ou déclaration
- – TAR à fonctionnement saisonnier ou permanent (avec ou sans possibilité d’arrêt)
Le diagnostic d’évaluation
Le diagnostic d’évaluation a pour objectif d’estimer le risque réel de développement des Legionella en tenant compte de son écologie. Il permet notamment d’évaluer l’efficacité du traitement de l’eau des TAR.
Le plan de surveillance
| Type de tours aéro-réfrigérantes concernée | Éléments d’information | Phénomènes biologiques observés | Objectifs visés |
|---|---|---|---|
| TAR ouvertes | Diagnostic précis | Cultivabilité des Legionella – Présence de biofilms – Présence d’amibes – Comportement de l’installation vis-à-vis de l’augmentation des populations de la flore totale et des Legionella | Comprendre les évolutions observées pendant la surveillance |
| TAR fermées | Diagnostic précis | Cultivabilité des Legionella – Présence de biofilms – Présence d’amibes – Comportement de l’installation vis-à-vis de l’augmentation des populations de la flore totale et des Legionella | Comprendre les évolutions observées pendant la surveillance |
| TAR soumises à autorisation ou déclaration | PCR Legionella sur eau en amont dispersion – ATP total sur eau en amont dispersion – Contrôle réglementaire XP T90-471 | Dénombrement Legionella totale – Évaluation de la biomasse planctonique – Cultivabilité des bactéries | Réduire le signal PCR ainsi que sa variation dans le temps |
| TAR à fonctionnement saisonnier ou permanent (avec ou sans possibilité d’arrêt) | PCR Legionella sur eau en amont dispersion – ATP total sur eau en amont dispersion – Contrôle réglementaire XP T90-471 | Dénombrement Legionella totale – Évaluation de la biomasse planctonique – Cultivabilité des bactéries | Alerter sur un accroissement significatif de la biomasse – Déclaration de conformité |
Le plan de surveillance résulte de la mesure d’indicateurs biologiques et physico-chimiques, selon une fréquence variable prédéfinie. Ces indicateurs sont prédictifs des dérives du réacteur biologique. Le plan de surveillance utilise les données du contrôle réglementaire et des diagnostics d’évaluation, complétées par des mesures PCR et ATP à cadence plus élevée.
faite selon quatre points :
- ➤ Détermination de la biomasse du biofilm et des populations de légionelles,
- ➤ Dénombrement et identification des Amibes,
- ➤ Analyse quantitative par PCR et par milieu de culture des légionelles planctoniques,
- ➤ Analyse par ATPmétrie de la flore totale active qui est un bon indicateur du niveau de contamination.
- ➤ Analyse quantitative par PCR des légionelles contenues dans les aérosols.
Exemple du déroulement d’une étude évaluant l’efficacité des traitements sur les installations de tours aéroréfrigérantes
Caractéristiques de l'installation : forage privé, fonctionnement sans arrêt, volume circuit 1 500 m³ et TAR ouverte. L’étude a été menée sur trois mois. Dix prélèvements ont été réalisés dont deux avant le début du traitement en guise de diagnostic microbiologique de départ.
L’évaluation chronique se fait sur quatre points du circuit (point chaud en circuit, stockage amont dispersion, bras mort : pompe de secours et en amont de la dispersion de la TAR) représentés respectivement par les quatre graphiques (cf figure 1).
Les résultats sont représentés sous forme d'histogrammes empilés. Trois indicateurs sur six font appel à la technique PCR. Il faut noter que les échelles sont différentes. Les barres en vert qui montrent la cultivabilité des légionelles sont inexistantes au point chaud en circuit, alors qu’elles sont toujours présentes pendant six semaines sur le point bras mort : pompe de secours et aléatoirement présentes sur les deux autres points. Le biofilm représenté en jaune ne réagit qu’après plusieurs semaines de traitement. Il est relativement stable jusqu’à sa disparition.
Interprétation des résultats (I)
- • L’approvisionnement en eau d’une TAR n’est pas neutre dans la contamination de son circuit. La mesure calculée du delta PCR (= valeur PCR Point chaud en circuit – la valeur de l’appoint en log (U.G/L)), permet d’estimer la prolifération ou la réduction de la population Legionella. Cela signifie que l’installation n’est pas la source de légionelles. C’est l’eau d’appoint qui amène la majeure partie des légionelles dans le circuit. Ces résultats nous ont amenés à préconiser un traitement de l’eau d’appoint.
- • Le contrôle réglementaire est opéré au point Amont dispersion. Il est basé sur le dénombrement des bactéries Legionella cultivables associé au risque de santé publique. La cultivabilité des légionelles est une caractéristique variable et temporaire et peu homogène sur les différents points de l’installation.
Conclusion
L’expérience acquise sur de nombreuses installations montre l’intérêt de surveiller la qualité microbiologique de l’eau d’appoint, qui fluctue en fonction des ressources captées (forage, adduction potable, adduction eau de surface), et du temps (influence des mélanges, des épisodes pluvieux).
Les différentes techniques de biologie moléculaire utilisées (eaux, biofilm, air) développées dans le cadre de l’action collective : Innovation Transfert de Technologie n° 2 “Surveillance complexe de l’écosystème microbien d’une TAR – Élaboration d'une méthodologie originale en routine de suivi de la qualité et prévention des risques” avec l’appui de la recherche publique permettent aujourd’hui d’appréhender la dynamique des populations microbiologiques au sein du réacteur TAR.
Combiné aux investigations classiques, cette méthodologie autorise un monitoring “temps réel” de l’évolution du risque Legionella dans la TAR. La microbiologie doit être examinée d’un point de vue dynamique et non pas statique avec des outils rapides et si possible à haut débit. Ces outils ne se substituent pas à la méthode de référence réglementaire (NF T90-431), ni aux autres mesures/enregistrements (hydraulique, physico-chimie, microbiologie sur gélose) mais les complètent efficacement.
Outil de mesure spécifique normalisé (XP T90-471), la PCR réclame néanmoins l’intervention de laboratoires “experts” capables de déterminer les points de prélèvement et surtout d’interpréter les résultats dans l’espace et dans le temps en perspective avec les autres indicateurs biologiques et physico-chimiques suivis sur l’installation.
Les outils proposés par Bio-Rad pour l’évaluation de l’efficacité d’un traitement, font partie d’un programme mis en place par cette société à l’échelle européenne, qui procure également un appui technique appréciable.
Outil rapide de quantification, la PCR permet également de faire des bilans microbiologiques entrée/sortie d’un équipement particulier, d’une portion de circuit et d’en déduire des informations pertinentes en matière de conduites des installations. Le gain économique engendré s’apprécie ici à la fois en termes d’optimisation des traitements, de sécurisation du fonctionnement de l’installation et diminution des impacts sur l’environnement (air, eaux résiduaires).
