Du fait du développement de certains pathogènes et des multiples pressions qui pèsent sur les ressources en eau, les techniques d'analyses microbiologiques restent un enjeu majeur de R&D.
Réalisé par , Technoscope
Le recours plus fréquent aux eaux de surface et l’adoption de nouveaux modes de vie et de production favorisent le développement de certains pathogènes et sont à l’origine de l’apparition de nouvelles maladies hydriques qui ont pour noms légionellose, cryptosporidiose, gastro-entérites d'origine virale ou bactérienne (en particulier Campylobacter), ou intoxication par les toxines d’algues. « Il convient de moduler ce propos dans la mesure où de nombreux pathogènes recherchés aujourd’hui ou identifiés comme source d’une contamination par l’eau ne faisaient pas l’objet de test il y a vingt-cinq ans », tempère Laurent Moulin, responsable du département des études biologiques du Centre de recherche et d’expertise de contrôle des eaux de Paris (Crecep). « Bien souvent, ces maladies appartenaient au monde médical et l’origine de l’infection était inconnue. Anciennes ou nouvelles, ce qui est sûr, c'est que les pathogènes responsables de ces maladies font l’objet d'une attention croissante et sont plus activement recherchés. De ce point de vue, les normes sont à la traîne ».
Pour tous ces micro-organismes anciens et nouveaux, les analyses microbiologiques doivent permettre d’identifier les espèces présentes, de déterminer si elles sont mortes ou vivantes – donc potentiellement dange
Aux techniques traditionnelles de culture – qui sont souvent les seules existantes en routine pour bon nombre d’organismes – s'ajoutent des techniques cellulaires plus sophistiquées ou encore les nouvelles méthodes issues de la biologie moléculaire. Plusieurs laboratoires tels que Bouisson Bertrand Laboratoires, Capsis, Ianesco-Chimie, Eurofins, Carso ou SGS Multilab disposent des compétences requises, des équipements performants et des agréments nécessaires pour mener à bien les différentes méthodes d’analyse et de contrôle des eaux. Les technologies se développent au rythme des réglementations et, à l’évidence, la technique miracle n’existe pas, ou pas encore. Il s'agit de choisir judicieusement son approche, voire de les combiner en fonction des espèces recherchées, de la qualité des matrices d’où elles sont extraites, des objectifs de la mesure et du degré de précision et de rapidité requis.
La culture a ses limites
Les techniques de détection traditionnelles s'appliquent en premier lieu aux bactéries. Elles consistent à déposer les échantillons sur un support nutritif adéquat pour la bactérie recherchée mais inhibant le développement de tout autre organisme. Les bactéries se reproduisent en formant des colonies – ce qui prouve leur viabilité et souvent leur pouvoir infectieux – et la mesure se fait en comptant les unités formant colonie. Outre que la culture peut être très longue (10 à 13 jours pour l'identification de légionelles), on sait aujourd’hui que cette quantification est peu précise et tend à sous-estimer le nombre de bactéries viables présentes dans l’échantillon. En effet, bien qu’elles soient viables, les bactéries stressées par des conditions environnementales (comme le chlore) et de culture défavorables ne se reproduisent pas. « La réglementation actuelle ne tient pas compte de l’incertitude des mesures », précise Valérie Rosenbaum, directrice du L.E. Lab’Eau de Lyonnaise des Eaux. « L’incertitude peut être de plus ou moins trois unités, alors que, par exemple, aucune E. coli ne doit être présente dans l’eau. Mais les techniques analytiques progressent rapidement et avec elles la possibilité d’être plus précis, plus rapide et de détecter de nouveaux pathogènes. »
Les techniques de culture servent également à détecter la présence de virus. Les virus sont pour la plupart constitués d'un génome (ADN ou ARN, une molécule légèrement différente de l’ADN) et d’une enveloppe de protéines. Pour se multiplier, ils détournent à leur profit les mécanismes vitaux de la cellule hôte (cellule ou bactérie). De ce fait, ils ne se reproduisent pas dans l’eau mais peuvent la contaminer avec les matières fécales. Leur pouvoir infectieux est beaucoup plus fort que celui des bactéries, ce qui explique que les virus soient responsables de 44 % des épidémies.
AES Chemunex table sur cette technologie très attrayante par sa sensibilité à l’unité viable par volume filtré et sa grande rapidité (quelques heures) pour la détection de bactéries dans l’eau, en premier lieu les légionelles, mais sont également visées d'autres bactéries comme E. coli. Grâce à une collaboration avec EDF, le CNRL (Centre national de référence des légionelles) et Philippe Lebaron de l'Observatoire océanologique de Banyuls-sur-Mer (CNRS/université Paris 6), des marqueurs immunologiques spécifiques de Legionella sp. et Legionella pneumophila, la plus dangereuse, ont été obtenus. Un kit est aujourd'hui disponible pour la détection de Legionella pneumophila dans les eaux chaudes sanitaires permettant de réaliser des contrôles en temps réel. Dans l'état actuel d'avancement de la technologie, ces marqueurs semblent être capables d’identifier les légionelles intra-amibiennes que l'on soupçonne être particulièrement virulentes. Ils devraient prochainement être couplés à des marqueurs de viabilité pour rendre le test complet.
De l’échantillon à la PCR
La société de biotechnologie GeneSystems® est spécialisée dans les méthodes d'analyse microbiologique par PCR Temps Réel, notamment dans le domaine de la qualité de l'eau. Outre la rapidité de la méthode, le principal avantage de leur solution est de standardiser et automatiser toute la chaîne de processus, de la préparation des échantillons au résultat de quantification. Cette méthode permet en particulier la détection de Legionella spp. et de Legionella pneumophila dans les échantillons d'eau mais aussi dans les échantillons non filtrables (boues de station d'épuration, etc.). Le procédé de lyse mécanique alliant la sonification (1 sonotrode par échantillon), le choc thermique et l'ajout de composés chimiques assure la lyse des légionelles intra biofilm et intra amibiennes. Cette méthode, conforme au projet de norme XP T 90-471, a été développée en partenariat avec Veolia Water et a fait l'objet d'une étude de validation avec Nalco. Bertrand Coissac, chef de produit chez GeneSystems®, estime que la technique Legionella apporte un plus dans le pilotage des réseaux d'eau et des chaînes de production : « Nos clients privilégient des analyses PCR régulières, afin de pouvoir contrôler en temps réel leurs réseaux, d'optimiser leurs stratégies de traitement et surtout de s'affranchir des risques sanitaires, réglementaires et économiques liés à la présence de ces pathogènes ».
Il n'existe cependant pas actuellement de méthode de routine pour isoler les virus dans l'eau. Quelques-unes seulement se reproduisent sur des cultures cellulaires, comme les entérovirus, les rotavirus ou les reovirus. Les entérovirus sont le groupe viral choisi comme indicateur de contamination. La norme XP T 90-451 définit sa concentration sur laine de verre (100 l d’eau, 10 l pour les eaux usées) puis détection par culture : leur multiplication prouve leur présence et leur caractère infectieux mais le processus de détection peut prendre plusieurs semaines. En revanche, les norovirus (ou Norwalk like), qui sont fréquemment impliqués dans les gastroentérites, ne sont pas cultivables. Ces virus à ARN sont aujourd'hui détectés par PCR inverse, c’est-à-dire une PCR réalisée sur l'ADN complémentaire obtenu à partir de l'ARN viral. La technique nécessite de récolter l’échantillon à partir de grands volumes d'eau sur des filtres spéciaux. Néanmoins, si les techniques moléculaires permettent aujourd'hui de détecter les norovirus, les astrovirus, les rotavirus et le virus de l’hépatite A dans les eaux de surface, elles ne permettent pas de savoir si le virus est infectieux. Leur détection est donc un motif d’enquête mais ne peut se suffire à lui-même.
Des techniques cellulaires pour les parasites
Certains parasites peuvent également être cultivés pour identification, comme les amibes, mais cette approche reste plus hasardeuse que pour les bactéries. Les plus recherchés à l'heure actuelle sont Cryptosporidium parvum, Giardia intestinalis et, plus récemment, Toxoplasma gondii qui a été responsable d'infections hydriques au Canada et en Italie. Cryptosporidium est aujourd'hui la cause d’épidémies fréquentes aux États-Unis, au Canada et en Europe, souvent associées à un fort taux de désinfection des eaux potables. La plus importante a eu lieu en 1993 à Milwaukee, touchant 400 000 personnes dont 4 000 hospitalisées et 69 morts. Giardia a été la cause d’épidémies en Suède et en Norvège.
Dans l'environnement, Cryptosporidium et Giardia se trouvent sous forme enkystée ce qui leur confère une grande résistance. La méthode normalisée Afnor NF T 90-455 détecte les formes enkystées. Elle consiste à concentrer les micro-organismes par filtration d'une grande quantité d'eau (100 l d’eau, 10 l pour les eaux usées) sur une cartouche. Les parasites sont ensuite capturés sur des billes recouvertes d'un anticorps monoclonal puis révélés par immunofluorescence. La membrane est examinée au microscope optique pour compter le nombre d’individus présents dans l’échantillon. Cette technique induit une incertitude de la lecture, notamment dans le cas d'un faible nombre d'individus présents. Des techniques automatiques de lecture par cytométrie à balayage permettent en revanche une quantification à l'unité près (voir encadré).
Une technique combinant les approches cellulaire et moléculaire pourrait se révéler intéressante pour d'autres micro-organismes, en particulier E. coli. En effet, il n'est pas toujours facile de trouver un anticorps suffisamment spécifique de l’espèce recherchée. Dans ce cas, on utilise plutôt une sonde nucléique qui va reconnaître une portion très spécifique du patrimoine génétique (ADN) du micro-organisme recherché (son empreinte génétique) par hybridation in situ. Cette technique permet de révéler l'ADN cible à l’intérieur même de l’organisme recueilli sur une membrane.
La technique moléculaire la plus développée est la PCR (Polymerase Chain Reaction), simple à mettre en œuvre et qui permet d’obtenir un résultat en quelques heures à un prix modéré. Il s'agit d’une technique d’amplification qui permet de multiplier les brins d’ADN afin de rendre le signal détectable.
Elle repose sur le fait que les deux brins d'ADN formant la double hélice, une fois séparés, tendent spontanément à se recombiner avec une séquence opposée leur correspondant. Ainsi les amorces utilisées, spécifiques de l'espèce recherchée, se combinent-elles à cet ADN. Si elle est couplée avec un fluorochrome, elle sera détectée. L'avantage, comme l’approche cellulaire, est de conserver intègre la bactérie mais elle est très difficile à réaliser, car elle repose sur des propriétés de perméabilité des membranes et sa limite de détection est relativement élevée. Il n'existe pas aujourd’hui de techniques de routine basées sur cette approche.
Un nouveau défi : détecter les cyanobactéries
Ni la culture ni la méthode cellulaire ne permettent en revanche de détecter les microcystines, des hépatotoxines libérées par les algues bleues (cyanobactéries).
Ces dernières sont éliminées par le traitement de l'eau, mais leurs toxines qui résistent aux méthodes de traitement habituelles sont libérées dans l'eau potable. Ces toxines très puissantes présentent un risque d'intoxication principalement pendant la période estivale et lorsque sont utilisées les eaux de surface, conditions favorables à leur développement.
Le décret de 2001 fixe à 0,1 µg/l la concentration maximale acceptable pour la microcystine-LR totale dans l'eau potable. « La recherche des cyanobactéries se fait régulièrement pour les eaux de Seine afin d’adapter les doses de coagulants nécessaires à la neutralisation des algues », explique Valérie Rosenbaum du L.E. Lab’Eau. « L’identification et le comptage des algues présentes dans l'eau se fait sur des cellules de comptage après décantation d'un échantillon d'eau, et la quantification des microcystines est effectuée par chromatographie gazeuse ».
Des techniques moléculaires (hybridation in situ et PCR) sont à l'étude, par exemple au Max Planck Institute (Brême, Allemagne), pour identifier et dénombrer les cyanobactéries. Le Laboratoire environnement et chimie analytique (École supérieure de physique et chimie industrielle/CNRS) développe une technique d’analyse puissante pour identifier et quantifier les différents variants de microcystine : couplage d'un immunoadsorbant constitué d’anticorps anti-microcystine et de la chromatographie associée à la spectrométrie de masse en tandem.
Autre approche : des biocapteurs capables de détecter en temps réel l'algue et sa toxine sont mis au point par plusieurs sociétés parmi lesquelles Aqua MS (Micro-Flu) et une société canadienne en biopharmaceutique, Biophage Pharma. Le biocapteur PDS® de Biophage Pharma permet de détecter en temps réel non seulement la présence des cyanobactéries (algues bleues) vivantes mais aussi la présence de leur toxine par évaluation de leur cytotoxicité. C'est une méthode alternative rapide pour effectuer des tests de cytotoxicité sans expérimentation animale, qui permet la surveillance des contaminations par les cyanobactéries toxiques. Diffchamb propose de son côté un test de terrain rapide et semi-quantitatif, le Microcystin Tube Kit, ainsi qu'un test quantitatif, le Microcystin Plate Kit (voir encadré). Ces tests peuvent être utilisés pour l’analyse de l’eau comme pour celle de produits à base d’algues. La limite de détection est de 0,3 ppb pour le format tube et inférieure à 0,15 ppb pour le format microplaque.
PCR : une technologie d’avenir pour l’environnement
La technique moléculaire la plus développée est la PCR (Polymerase Chain Reaction), simple à mettre en œuvre et qui permet d'obtenir un résultat en quelques heures à un prix modéré. Il s’agit d'une technique d'amplification qui permet de multiplier les brins d’ADN afin de rendre le signal détectable.
Très sensible pour la détection (seuil de 160 µg/l), sa limite de quantification se situe autour de 960 µg/l selon une étude des laboratoires Bouisson-Bertrand, ce qui peut néanmoins poser des problèmes dans le cas où l'on veut être capable de détecter un seul.
individu comme pour les microsporidies. Ces caractéristiques expliquent l’engouement pour la PCR qui, dans le domaine de l’eau, est en premier lieu développée pour l’identification des légionelles par des sociétés telles que Genesystems, Biorad, Applied Biosystems ou encore Genolife. Nombreux sont par conséquent les laboratoires à proposer des analyses PCR, parmi lesquels Bouisson-Bertrand, Eurofins, Hygidiag, SGS Multilab, Ampligene, IRH Environnement ou Alcontrol Cervac. Mais certains de ces kits actuellement sur le marché ne seront pas conformes aux exigences de la norme Afnor prévue pour ce printemps. En effet, si cette technologie est très prometteuse, elle est néanmoins délicate à réaliser. Une première limite, inhérente à la technologie elle-même, est le risque de faux positifs. L’ADN peut subsister très longtemps à l’état libre dans l’environnement. La PCR ne peut donc pas différencier les cellules vivantes et mortes, ce qui rend très difficile l’interprétation des résultats. Ce paramètre peut ne pas être important, par exemple s’il s’agit de tester l’efficacité d’un traitement membranaire, mais il l’est quand il s’agit de rechercher un agent pathogène dans l’eau potable. Une solution serait par exemple d’utiliser la PCR inverse comme pour les virus à ARN. Il s’agirait alors d’identifier l’ARN correspondant à des séquences d’ADN spécifiques et qui n’est produit que si la cellule est vivante. « C’est une solution séduisante, explique Laurent Moulin du Crecep, mais la technique est très sensible à toute perturbation de la procédure et il sera de ce fait beaucoup plus compliqué de mettre des normes en place ». Une autre solution, de type mécanique, a été adoptée par Genesystems et s’appuie sur un tri préalable des cellules mortes et vivantes (voir l’encadré 2).
La méthode souffre également d’un biais inverse. Les étapes de prétraitement nécessaires pour extraire l’ADN et le mettre sous une forme utilisable par la PCR sont susceptibles d’induire de faux négatifs. La matrice contient des inhibiteurs que l’on ne sait pas bien caractériser et qu’il faudrait pouvoir contrôler au moment de l’analyse. Actuellement les techniques d’extraction de l’ADN permettent le plus souvent de limiter le pourcentage de ces réactions faussement négatives.
Jérôme Etienne, directeur du Centre national de référence des Légionelles à Lyon, a comparé les résultats obtenus par différentes méthodes de PCR à ceux issus de la technique de culture de référence : « Nous observons une bonne concordance entre les résultats lorsqu’il s’agit d’eaux sanitaires. Ce n’est pas le cas des résultats obtenus pour les eaux provenant des tours aéro-réfrigérantes qui sont beaucoup plus contaminées. Dans ce cas, la PCR détecte plus souvent des pathogènes que la culture. On ne sait pas si cela anticipe la survenue d’un danger réel. Désinfecter systématiquement est alors une façon sécurisante de réduire au maximum le risque de transmission des légionelles à l’homme, mais les risques délétères que cela entraîne pour l’environnement doivent être sérieusement évalués ». En tout état de cause, les techniques de PCR doivent être standardisées au sein de chaque laboratoire ou bien reposer sur l’utilisation de kits technologiques standardisés et automatisés qui permettent de limiter la variabilité dans l’application de la méthode. Pour Nadine Dumoutier, expert en microbiologie au Cirsee, le centre de recherche Suez Environnement/Biomérieux, « les techniques de biologie moléculaire nécessitent technicité et expérience pour acquérir un recul suffisant et bien maîtriser leur utilisation et surtout leur interprétation. Beaucoup de recherche et de développement doivent encore être réalisés mais, à mon sens, PCR et PCR inverse sont les méthodes probablement les plus adaptées aux besoins en environnement ».
De son côté, Diffchamb propose depuis quelques mois une nouvelle méthode mise au point par la société allemande Vermicon, baptisée Scan Vit Legionella. Elle consiste à filtrer 20 ml d’eau sur un filtre qui, après un traitement acide afin d’empêcher la prolifération de la flore interférente, est mis en contact avec une gélose GVPC. La boîte est ensuite mise en culture. À l’issue de cette phase, les colonies sont colorées grâce à des sondes d’hybridation ARN spécifiques de Legionella spp et pneumophila. Les colonies vertes sont comptées comme des Legionella spp et les rouges comme des pneumophila. Cette méthode présente l’avantage d’être plus rapide que la NF T 90-431. Elle permet d’identifier toutes les colonies dénombrées en termes de Legionella spp et Legionella pneumophila. Scan-Vit Legionella permet d’obtenir un résultat en 72 heures.
Ces techniques progressent très vite aujourd’hui et le rêve moléculaire actuel est la puce ADN, ou laboratoire sur puce, étudiée par de nombreux laboratoires comme Suez Environnement/Biomérieux en France ou l’Institut de recherche en biotechnologie au Canada. Ce sont de petits supports sur lesquels on greffe des sondes correspondant à différents micro-organismes et qui permettraient en un seul test de s’assurer de l’absence de 50, voire 500 pathogènes, simultanément. « Les biopuces existent aujourd’hui pour des applications essentiellement médicales mais il faudra encore beaucoup de recherche et un marché porteur pour que cette technologie puisse un jour être utilisée en routine en environnement », conclut Nadine Dumoutier. Mais pour tous les spécialistes, les techniques existantes sont complémentaires et il est important de bien connaître leurs spécificités pour les utiliser au mieux.
