Récemment, un regain d'intérêt est porté à l'utilisation de résidus ligneux pour la production d'énergies renouvelables. Cela présente divers avantages mais également un défi technologique, de par la difficulté à hydrolyser la lignine contenue dans les végétaux. Ainsi, des prétraitements sont nécessaires. Le faible coût d'un prétraitement par des champignons est attrayant. Aussi, le projet ANR STOCKACTIF étudie et optimise ce prétraitement. Lors de la première étape du projet, une souche fongique a été retenue, notamment vis-à-vis de son aptitude à accroître la quantité de méthane libérée par une paille prétraitée (jusqu'à 38 % de plus par rapport à la MV de la paille témoin). En tenant compte des pertes de matière observées lors du prétraitement en conditions non optimisées, il a été constaté jusqu'à 14 % de méthane en plus pour la paille prétraitée par rapport à la paille témoin.
Les végétaux ou biomasse lignocellulosique (BL) sont un substrat de choix pour la production énergétique car ils sont renouvelables, largement disponibles et riches en sucres (55-75 % MS) (Wan & Li, 2012). De plus, la méthanisation de la biomasse lignocellulosique (résidus agricoles…) possède un intérêt croissant notamment parce qu'elle engendre une compétition limitée vis-à-vis de l'utilisation des terres pour les cultures alimentaires. Cette compétition doit impérativement être prise en compte dans la stratégie de développement des énergies renouvelables. D’ailleurs, les cultures énergétiques étaient pointées du doigt dès 2007, avec la crise alimentaire. Les résidus de culture, tels que les pailles, sont donc à privilégier.
La biomasse lignocellulosique (BL) est constituée de cellulose, des hémicelluloses et de la lignine. L'hydrolyse de la lignine est difficile et celle-ci est faiblement biodégradable en anaérobiose. De plus, dans la BL, les liaisons et interactions entre la lignine et les autres polymères rendent les sucres fermentescibles peu accessibles. Chandler et al. (1980) montrent qu’un pourcent de lignine décroît la digestion des matières organiques d’environ 3 % (Lesteur et al., 2010). Par conséquent, des prétraitements sont nécessaires pour faciliter l’accès aux sucres fermentescibles des BL (Monlau et al., 2013).
Ces prétraitements, notamment physiques (broyage…) et thermo-chimiques (alcalin, acide…) représentent parfois jusqu’à la moitié de l’énergie utilisée lors de la transformation du substrat. Il s’agit donc d’une étape coûteuse représentant un obstacle significatif pour la commercialisation des procédés de production bioénergies et pouvant générer des quantités importantes de déchets. Par ailleurs, la directive européenne 2009/28/CE impose des performances environnementales pour les carburants d’origine renouvelable et c’est tout le cycle de vie qui doit être étudié. Or, les prétraitements biologiques (champignons, enzymes...) présentent
considérablement moins d’inconvénients. En particulier, l'utilisation de prétraitements fongiques permettrait un gain économique par une faible utilisation d’énergie (température ambiante, pas d’ajout de produits chimiques...). Ils sont aussi moins coûteux que les traitements enzymatiques qui nécessitent des étapes de production et d’extraction d’enzymes. D’autre part, les champignons ont également un intérêt environnemental avec une moindre consommation d’intrants et une faible production d’inhibiteurs et de déchets. Néanmoins, ce type de prétraitement requiert plusieurs semaines pour l’établissement d’une population fongique suffisante pour altérer significativement la matière.
Ainsi, l'idée d'utiliser la période de stockage du substrat pour le pré-traiter a germé. Le projet ANR Stockactif duquel découle ce travail s’intéresse ainsi à la croissance des champignons lignolytiques par fermentation en milieu solide (FMS). La culture en milieu solide possède l'avantage d'une charge en substrat beaucoup plus importante que pour une culture en milieu liquide, du fait de l’absence de volume occupé par la phase aqueuse. Par comparaison, la FMS facilite l’attachement des enzymes au substrat de par le réseau mycélien. La diffusion de l'oxygène, nécessaire à la délignification, est favorisée. De plus, le coût est moindre par rapport à la culture liquide (moins d’agitation, d’aération et de chauffage) (Tian et al., 2012).
Le prétraitement fongique recherché devra entre autres limiter l’hydrolyse des polymères glucidiques (cellulose et hémicelluloses) car il s’agit des substrats pour la production d’énergie. D’autre part, il faudra veiller à étudier la co-habitation de la souche sélectionnée avec la flore endogène, puisque cette dernière peut limiter l'étape de prétraitement (consommation de sucres hydrolysés, limitation de l'implantation du champignon retenu...). Les enjeux du projet consistent à préserver un maximum de « potentiel d'utilisation de la biomasse » (bioéthanol, biogaz et synthons) ; à identifier des conditions de stockage reproductibles et à favoriser la faisabilité industrielle (minimisation des coûts...). Le substrat retenu pour l’aspect biogaz est la paille de blé car il s'agit :
- — d'un modèle expérimental notamment parce que la composition de la matière organique (MO) est représentative des biomasses herbacées (Vassilev et al., 2012) ;
- — de la principale ressource mobilisable de résidus agricoles en France (ADEME, 2006) ;
- — d'une biomasse permettant de remédier au problème de la saisonnalité des substrats.
La première étape du projet, qui est développée ici, consistait à choisir les souches les plus performantes pour délignifier la paille de façon sélective (peu de consommation des sucres et de pertes de matière). Ces souches étaient sélectionnées parmi des basidiomycètes puisqu’il s’agit des dégradeurs les plus efficaces parmi les champignons (Hammel, 1997 ; Sánchez, 2009).
Dans un premier temps, l'UMR BCF a réalisé un crible miniaturisé (300 mg de paille traitée en microplaques deep-well) sur 177 souches. Ces dernières étaient choisies pour obtenir une représentativité des genres, des espèces et des particularismes géographiques. Après une FMS dans des conditions favorables, diverses mesures ont été effectuées sur les pailles prétraitées (Zhou et al., en préparation). Celles-ci visaient notamment à explorer l’accessibilité des sucres solubles dans l'eau et après hydrolyse afin de déterminer les meilleures souches candidates pour la méthanisation. Suite au crible, seize souches ont été présélectionnées.
Matériel et méthodes
Prétraitement fongique
FMS en système miniaturisé
Les seize souches candidates sont anonymisées dans les résultats en vue d'un éventuel dépôt de brevet. Elles ont été cultivées de nouveau en trois lots (ayant lieu à des moments différents dans l’année). Les prétraitements ont été réalisés sur trois microplaques deep-well (100 mg/puits, soit environ 2,5 g/deep-well). Le substrat (paille stérilisée, broyée à 4 mm) est inoculé avec une quantité standard de champignons et une solution nutritive est ajoutée. Cet ajout d’une source de carbone et d’azote a pour but d’assurer le début de croissance du champignon. Pour le lot 1, 200 mg de glucose/g MS de paille et 18,4 mg de ditartrate d’ammonium/g MS ont été ajoutés tandis que ces quantités ont été divisées par quatre pour les lots 2 et 3, afin de réduire la proportion de méthane issu de l’ajout de la solution nutritive. La paille est ensuite prétraitée sous une humidité constante durant 12 jours à 25 °C. Les mesures de potentiel méthanogène ont eu lieu en trois séries différentes (une par lot). Un témoin (T) a été réalisé : paille de blé non ensemencée et traitée dans les mêmes conditions.
FMS en colonne
D’autres échantillons ont été obtenus avec une plus grande quantité de substrat dans des colonnes FMS en verre. Une colonne contient 20 g de matière sèche (MS) de paille de blé, 25 mg de glucose/g MS et 2,5 mg de tartrate diammonium/g MS. Chaque colonne est ensemencée avec une même quantité MS de broyat mycélien. Les colonnes sont thermostatées à 28 °C. La rétention d'eau initiale de la paille est de 90 %. Un flux d’air ascendant saturé en humidité est contrôlé à 120 ml/min par un débitmètre à bille.
Pour chacune des souches, les cultures colonnes FMS ont été triplées et les pailles de blé prétraitées obtenues homogénéisées pour fournir des lots de substrats en quantités suffisantes pour leurs analyses. Ici aussi, un témoin (T) est réalisé (culture FMS sans inoculation).
Mesure du potentiel méthanogène ou BMP (Biochemical Methane Potential)
Méthodologie
Les BMP des pailles prétraitées ont été mesurés afin de connaître la quantité maximale de méthane qui puisse être obtenue pour ces substrats. Les fioles BMP de 600 ml ont un volume utile de 400 ml ; celui-ci contient le substrat (1,3 g MS/fiole), un inoculum de méthaniseur (= 3 g MV/L), de l'eau, des macro- et micro-éléments ainsi qu'un tampon bicarbonate afin de s’assurer de conditions optimales de méthanisation (voir Monlau et al., 2012 pour la composition exacte du milieu).
Des duplicats ont été réalisés pour la paille prétraitée en microplaques deep-well et des triplicats ont été effectués pour les souches cultivées en colonne FMS. Les fioles sont placées à 36 °C sous agitation et le suivi de la production de biogaz se fait par mesure.
de pression, jusqu'à la fin de production (phase plateau). La mesure de la composition du biogaz a été effectuée pour chaque relevé de pression avec une analyse par micro-chromatographie en phase gazeuse : Varian GC-CP4900 (voir Motte et al., 2014 pour plus de précision). Les valeurs des volumes sont exprimées dans les conditions normales de température et de pression (NmL).
Normalisation des résultats BMP
Étant donné les deux concentrations différentes de solution nutritive et les trois séries de BMP, il a été choisi de normaliser les résultats pour pouvoir comparer tous les échantillons entre eux. Une correction du BMP de la paille traitée (BMPₓ) est effectuée pour gommer l’effet de la solution nutritive. Cette correction est justifiée car la solution a été transformée en champignon (BMP élevé) ou est restée sur la paille mais, dans tous les cas, elle correspond à une biomasse facilement dégradable. De plus, l’écart entre le BMP de la paille témoin (BMPᵣ) et le BMP de la paille témoin avec starter correspond à la quantité théorique de méthane attendue pour le starter (données non montrées). Les BMP sont ensuite normalisés par rapport au BMP de la paille témoin pour calculer le ratio Amélioration 1 :
Amélioration 1 = (BMPₓ – starter)/BMPᵣ
avec BMPₓ : BMP de la paille prétraitée par la souche X ; starter : quantité théorique de méthane produite à partir de la solution nutritive ; BMPᵣ : BMP de la paille témoin.
BMPₓ, starter et BMPᵣ sont exprimés en NmL/g MV prétraitée. Lors du prétraitement il y a eu des pertes de matière (de 10 à 20,5 % selon les souches) qui peuvent amoindrir l’efficacité du prétraitement pour la conversion du substrat en méthane, en particulier si les pertes concernent les sucres fermentescibles. Afin de considérer cette perte, les BMP ont été exprimés en NmL/g MS initiale et le ratio Amélioration 2 a été calculé :
Amélioration 2 = (BMPₓ – starter)/BMPᵣ
avec BMPₓ, starter et BMPᵣ en NmL/g MS initiale.
Résultats et discussions
Échantillons issus des cultures FMS en microplaques deep-well
La figure 1 montre l’amélioration du potentiel méthane par rapport à la paille témoin et rapportée à la matière volatile de pailles prétraitées. Certaines souches ont un ratio Amélioration 1 inférieur à un. Elles ont donc un BMP moindre que celui de la paille non traitée ; il est possible que les consommations de cellulose et hémicelluloses aient été trop importantes, cette hypothèse devant être vérifiée. Ces souches ne semblent donc pas présenter d'intérêt vis-à-vis de l'objectif. D'un autre côté, les souches dont la valeur haute de l’écart-type est supérieure à un sont intéressantes (voir encadré noir sur la figure 1). Il peut être observé jusqu’à 40 % d’amélioration.
Si l’on tient compte de la perte de matière grâce au ratio Amélioration 2, le nombre de souches d’intérêt est encore réduit (voir encadré noir sur la figure 2) et jusqu’à 20 % d'amélioration peuvent être attendus.
Les souches jugées comme non performantes par rapport au critère Amélioration 1 appartiennent toutes exclusivement au lot 1 (souches B à H) ; elles ont reçu plus de starter (majoritairement du glucose) que les autres. Or, selon Reid et Deschamps (1991), le glucose comme co-substrat avec une lignine de synthèse limiterait la délignification. Il est donc possible que la plus grande quantité de glucose reçue par le lot 1 ait limité la performance des souches concernées. Des tests complémentaires sont cependant nécessaires pour confirmer ou infirmer l'effet du glucose sur la délignification dans nos conditions de culture. Il faut donc néanmoins rester prudent quant à l’interprétation des résultats du lot 1 en microplaques deep-well (souches B à H).
Comparaison avec les échantillons issus des cultures FMS en colonnes
Afin de compléter les premières analyses, d'autres essais de FMS ont été réalisés à plus grande échelle et avec les mêmes conditions d’ajout de glucose (tableaux I et II). Afin de pouvoir comparer ces résultats avec ceux obtenus en microplaques, l’amélioration du BMP est exprimée comme suit : (BMPₓ – BMPₒ)/BMPᵣ.
Dans ces conditions, certaines souches du lot 1 paraissent intéressantes, c’est notamment le cas des souches G et F, ce qui semblerait démontrer l’effet négatif d'une
concentration trop élevée en glucose sur la délignification.
Par comparaison avec les cultures en microplaques et sans prise en compte du lot 1 (souche B à H), les mêmes souches d’intérêt ressortent pour des résultats rapportés à la matière volatile prétraitée (figure 1 et Tableau I). Ainsi les souches N, J, I et A permettent d’accroître le BMP (NmL/g MV) quel que soit le mode de FMS. On remarque toutefois que la souche N donne de meilleurs résultats en colonne puisque le BMP (NmL/g MV) est amélioré de 21 % contre moins de 2 % après culture en microplaques. La souche E semble quant à elle sans intérêt pour l’objectif fixé. D’autre part, si le BMP par rapport à la MS initiale est observé (Tableau II), l’ordre croissant A, J, I est conservé de la même façon que dans Amélioration 2 (souche N déplacée). Cependant, de rares pailles prétraitées en colonne ont un BMP supérieur à celui du témoin lorsqu'on tient compte des pertes (c’est-à-dire par rapport à la MS initiale). L’optimisation des conditions de cultures (durée de FMS, température, humidité…) prévue dans la suite de ce travail devrait permettre une plus grande amélioration. En effet, elles ont une grande influence sur le processus de délignification (Wan & Li, 2012).
Enfin, on note un intérêt de la souche F pour le prétraitement, même après prise en compte des pertes de matières (Tableaux I et II).
Ici, seules les valeurs du potentiel méthanogène ont été étudiées mais le prétraitement fongique devrait aussi entraîner une amélioration de la cinétique de production de méthanisation. Celle-ci présenterait, en effet, un intérêt pour les installations industrielles. Elle sera étudiée dans la suite en réacteurs continus en voie sèche (15 L) et voie humide (5 L).
Conclusion
Suite à ces premiers résultats, une souche a été retenue. Il s’agit de la souche F qui donnait les meilleurs résultats en colonne même en tenant compte des pertes de matière. Pour cette souche, les paramètres de culture vis-à-vis de la délignification « sélective » seront optimisés. Cette optimisation se fera en culture colonne (20 g MS) puis de la paille sera prétraitée en pilote (1 kg).
Le prétraitement de la paille à plus grande échelle soulève un besoin de limiter les contaminations du substrat afin de contrôler la réaction. Si le prétraitement se fait dans un réacteur, celui-ci devra être pensé pour éviter des zones difficiles d’accès et la marche à suivre en cas de développement important de contaminants est aussi en cours d’étude. Une réflexion est également menée avec les partenaires industriels du projet (Solagro, Vivescia et Établissements Soufflet) quant à la conduite du prétraitement fongique à l’échelle industrielle. En fin de projet (2015-2016), il est prévu d’utiliser de la paille fongiquement prétraitée en remplacement d'une partie de la ration d'un méthaniseur industriel.
Remerciements
Les auteurs remercient l'Agence Nationale de Recherche pour son soutien financier au travers du projet ANR-12-BIOME-0009.
Tableau I : BMP et amélioration apportée pour des pailles prétraitées en colonnes rapportés à la MV ¹
| Souches | BMP (NmL CH₄/g MV prétraitée) | Écart-type | Amélioration (%) |
|---|---|---|---|
| E | 178 | 17 | –7 |
| Témoin | 194 | 9 | 0 |
| A | 202 | 2 | 4 |
| J | 224 | 9 | 16 |
| I | 234 | 12 | 17 |
| N | 245 | 18 | 21 |
| F | 298 | 28 | 54 |
Tableau II : BMP et amélioration apportée pour des pailles prétraitées en colonnes rapportés à la MS initiale ¹
| Souches | BMP (NmL CH₄/g MS initiale) | Écart-type | Amélioration (%) |
|---|---|---|---|
| A | 158 | 15 | –14 |
| J | 162 | 14 | –13 |
| N | 163 | 12 | –11 |
| Témoin | 184 | 9 | 0 |
| I | 185 | 2 | 0,6 |
| F | 191 | 8 | 4 |
¹ Résultats non définis (plateau de fin de production non atteint)
Références bibliographiques
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Chandler, J. A., & Jewell, W. J. (1980). Predicting methane fermentation biodegradability (p. 234). Solar Energy Research Institute.
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Monlau, F., Barakat, A., Trably, E., Dumas, C., Steyer, J-P., & Carrere, H. (2013). Lignocellulosic Materials Into Biohydrogen and Biomethane: Impact of Structural Features and Pretreatment. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 43(3), 260-322.
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Motte, J-C., Escudié, R., Beaufils, N., Steyer, J.P., Benet, N., Delgenès, J-P., & Dumas, C. (2014). Morphological structures of wheat straw strongly impacts its anaerobic digestion. Industrial Crops and Products, 52, 695-701. doi:10.1016/j.indcrop.2013.11.038
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